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III. Arbeitsschritte

Arbeitsschritt	Wichtige Hinweise
Arbeitsschritt 1: Bindung von Antigen p53
Pipettieren Sie jeweils 50 yl des Antigens p53 in die beschrifteten Vertiefungen des Mikrotiterstreifens und lassen Sie die Proben 5 Minuten stehen.	Die Proteine binden unspezifisch an die Kunststoffoberflache.
Entleeren Sie danach die Platte und drücken Sie die Platte mit den Öffnungen nach unten auf einen Stapel Papiertücher; klopfen Sie die Platte vorsichtig aus.	Die Pipettenspitze muss nicht gewechselt werden.

Arbeitsschritt 2
Pipettieren Sie 100 yl Blocklösung in die Vertiefungen des Mikrotiterstreifens.	Bie diesem Schritt werden die unspezifischen Bindungsstellen auf der Oberfläche des Mikrotiterstreifens blockiert.
	Die Pipettenspitze muss nicht gewechselt werden.
Lassen Sie den Ansatz 5 Minuten stehen. Entleeren Sie den Streifen (siehe oben).
Arbeitsschritt 3: Herstellung der Serum-Verdünnungen	Vorsicht: menschliche Blutseren können Krankheitserreger enthalten! Handschuhe tragen.
50 yl des Standard-Serums "P" (= Positiv-Kontrolle) bzw. der Patientenseren "A-F" sind in die Reaktionsgefäße vorgegeben. HIerzu jeweils 200 yl Verdünnungspuffer geben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren (nicht schütteln) mischen.	Bei diesem Arbeitsschritt die Pipettenspitze wechseln.
Arbeitsschritt 4
Pipettieren Sie die 50 yl des Serums "P" (= Positiv-Kontrolle) sowie jeweils 50 yl der Patienten-Seren "A-F" aus den Reaktionsgefäßen in die entsprechenden Vertiefungen des Mikrotiterstreifens. In die Vertiefung "0" werden 50 yl Verdünnungspuffer pipettiert.	Bei diesem Schritt binden die Antikörper im Serum an das auf der Platte gebundene Antigen.
Bei diesem Arbeitsschritt die Pipettenspitze wechseln.
Lassen Sie den Ansatz 15 Minuten stehen. Entleeren Sie die Streifen (siehe oben).	Zusatzaufgabe: Während der Inkubationszeit Informationsblatt 7 zu p53 lesen! (Der Rest ist Hausaufgbe)
Arbeitsschritt 5: Waschen des Mikrotiterstreifens
Befüllen Sie die Vertiefung der Mikrotiterstreifen mit jeweils 150 yl Waschpuffer. Entleeren Sie die Streifen erneut (siehe oben).	Das Waschen entfernt alle unspezifischen Antikörper und anderen Serumproteine.
	Die Pipettenspitze muss nicht gewechselt werden.
Wiederholen Sie den Waschvorgang noch 2 mal.
Arbeitsschritt 6: Bindung des Sekundär-Antikörpers
Pipettieren Sie 50 yl des Sekundär-Antikörpers in die Vertiefung des Mikrotiterstreifens.	Bei diesem Schritt binden die Sekundär-Antikörper an die Antikörper aus dem Serum.
	Die Pipettenspitze muss nicht gewechselt werden.
Warten Sie 5 Minuten. Entleeren Sie den Streifen (siehe oben).
Arbeitsschritt 7: Waschen des Mikrotiterstreifens
Waschen Sie den Streifen erneut wie in Arbeitsschritt 5 beschrieben.	Das Waschen entfernt nicht- bzw. unspezifisch gebundene Sekundär-Antikörper. Die Pipettenspitze muss nicht gewechselt werden.
Arbeitsschritt 8: Farbreaktion
Pipettieren Sie im Abstand von 15 Sekunden je 50 yl Enzymsubstrat TMB in die Vertiefungen des Mikrotiterstreifens. Beginnen Sie bei Vertiefung "0".	Die Umsetzung des Substrats durch die an den Sekundärantikörper gekoppelte Peroxidase führt zur Bildung eines blauen Farbstoffes.
	Die Pipettenspitze muss nicht gewechselt werden.
Warten Sie nach der letzten Zugabe des Enzymsubtrats genau 3 Minuten.
Arbeitsschritt 9: Abstoppen der Reaktion	Vorsicht: Salzsäure ist stark ätzend! Handschuhe und Schutzbrille tragen!
Pipettieren Sie in der gleichen Reihenfolge wie in Arbeitsschritt 8 im Abstand von 15 Sekunden je 150 yl Stopplösung in die Vertiefungen des Mikrotiterstreifens. Beginnen Sie bei Vertiefung "0".
	Die Verschiebung des pH-Wertes durch die Stopplösung beendet die Reaktion und führt zu einem Farbumschlag nach Gelb. Nach dem Abstoppen bleibt die Farbintensität stabil.

Quelle (verändert nach):

Dr. Thomas Wendt, Dr. Rolf Lutz, Dr. Fred Engelbrecht:

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