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III. Ar­beits­schrit­te

 

Ar­beits­schritt Wich­ti­ge Hin­wei­se

Ar­beits­schritt 1: Bin­dung von An­ti­gen p53

 
Pi­pet­tie­ren Sie je­weils 50 yl des An­ti­gens p53 in die be­schrif­te­ten Ver­tie­fun­gen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens und las­sen Sie die Pro­ben 5 Mi­nu­ten ste­hen. Die Pro­te­ine bin­den un­spe­zi­fisch an die Kunst­stof­fo­ber­fla­che.
Ent­lee­ren Sie da­nach die Plat­te und drü­cken Sie die Plat­te mit den Öff­nun­gen nach unten auf einen Sta­pel Pa­pier­tü­cher; klop­fen Sie die Plat­te vor­sich­tig aus. Die Pi­pet­ten­spit­ze muss nicht ge­wech­selt wer­den.
Reihe
Ar­beits­schritt 2  
Pi­pet­tie­ren Sie 100 yl Block­lö­sung in die Ver­tie­fun­gen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens. Bie die­sem Schritt wer­den die un­spe­zi­fi­schen Bin­dungs­stel­len auf der Ober­flä­che des Mi­kro­ti­ter­strei­fens blo­ckiert.
Blocklösung Die Pi­pet­ten­spit­ze muss nicht ge­wech­selt wer­den.
Las­sen Sie den An­satz 5 Mi­nu­ten ste­hen. Ent­lee­ren Sie den Strei­fen (siehe oben).  
Ar­beits­schritt 3: Her­stel­lung der Serum-Ver­dün­nun­gen Vor­sicht: mensch­li­che Blutse­ren kön­nen Krank­heits­er­re­ger ent­hal­ten! Hand­schu­he tra­gen.
50 yl des Stan­dard-Se­rums "P" (= Po­si­tiv-Kon­trol­le) bzw. der Pa­ti­en­ten­se­ren "A-F" sind in die Re­ak­ti­ons­ge­fä­ße vor­ge­ge­ben. HIer­zu je­weils 200 yl Ver­dün­nungs­puf­fer geben und durch mehr­ma­li­ges Auf- und Ab­pi­pet­tie­ren (nicht schüt­teln) mi­schen. Bei die­sem Ar­beits­schritt die Pi­pet­ten­spit­ze wech­seln.
Ar­beits­schritt 4  
Pi­pet­tie­ren Sie die 50 yl des Se­rums "P" (= Po­si­tiv-Kon­trol­le) sowie je­weils 50 yl der Pa­ti­en­ten-Seren "A-F" aus den Re­ak­ti­ons­ge­fä­ßen in die ent­spre­chen­den Ver­tie­fun­gen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens. In die Ver­tie­fung "0" wer­den 50 yl Ver­dün­nungs­puf­fer pi­pet­tiert. Bei die­sem Schritt bin­den die An­ti­kör­per im Serum an das auf der Plat­te ge­bun­de­ne An­ti­gen.

Reihe 2

Bei die­sem Ar­beits­schritt die Pi­pet­ten­spit­ze wech­seln.

Las­sen Sie den An­satz 15 Mi­nu­ten ste­hen. Ent­lee­ren Sie die Strei­fen (siehe oben). Zu­satz­auf­ga­be: Wäh­rend der In­ku­ba­ti­ons­zeit In­for­ma­ti­ons­blatt 7 zu p53 lesen! (Der Rest ist Haus­auf­g­be)
Ar­beits­schritt 5: Wa­schen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens  
Be­fül­len Sie die Ver­tie­fung der Mi­kro­ti­ter­strei­fen mit je­weils 150 yl Wasch­puf­fer. Ent­lee­ren Sie die Strei­fen er­neut (siehe oben). Das Wa­schen ent­fernt alle un­spe­zi­fi­schen An­ti­kör­per und an­de­ren Se­rum­pro­te­ine.
Waschtag Die Pi­pet­ten­spit­ze muss nicht ge­wech­selt wer­den.
Wie­der­ho­len Sie den Wasch­vor­gang noch 2 mal.  
Ar­beits­schritt 6: Bin­dung des Se­kun­där-An­ti­kör­pers  
Pi­pet­tie­ren Sie 50 yl des Se­kun­där-An­ti­kör­pers in die Ver­tie­fung des Mi­kro­ti­ter­strei­fens. Bei die­sem Schritt bin­den die Se­kun­där-An­ti­kör­per an die An­ti­kör­per aus dem Serum.
Sekundär Die Pi­pet­ten­spit­ze muss nicht ge­wech­selt wer­den.
War­ten Sie 5 Mi­nu­ten. Ent­lee­ren Sie den Strei­fen (siehe oben).  
Ar­beits­schritt 7: Wa­schen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens  
Wa­schen Sie den Strei­fen er­neut wie in Ar­beits­schritt 5 be­schrie­ben.

Das Wa­schen ent­fernt nicht- bzw. un­spe­zi­fisch ge­bun­de­ne Se­kun­där-An­ti­kör­per.

Die Pi­pet­ten­spit­ze muss nicht ge­wech­selt wer­den.

Ar­beits­schritt 8: Far­bre­ak­ti­on  
Pi­pet­tie­ren Sie im Ab­stand von 15 Se­kun­den je 50 yl En­zym­sub­strat TMB in die Ver­tie­fun­gen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens. Be­gin­nen Sie bei Ver­tie­fung "0". Die Um­set­zung des Sub­strats durch die an den Se­kun­där­an­ti­kör­per ge­kop­pel­te Per­oxi­da­se führt zur Bil­dung eines blau­en Farb­stof­fes.
TMB Die Pi­pet­ten­spit­ze muss nicht ge­wech­selt wer­den.
War­ten Sie nach der letz­ten Zu­ga­be des En­zym­sub­trats genau 3 Mi­nu­ten.  
Ar­beits­schritt 9: Ab­stop­pen der Re­ak­ti­on Vor­sicht: Salz­säu­re ist stark ät­zend! Hand­schu­he und Schutz­bril­le tra­gen!
Pi­pet­tie­ren Sie in der glei­chen Rei­hen­fol­ge wie in Ar­beits­schritt 8 im Ab­stand von 15 Se­kun­den je 150 yl Stopp­lö­sung in die Ver­tie­fun­gen des Mi­kro­ti­ter­strei­fens. Be­gin­nen Sie bei Ver­tie­fung "0".  
Stopplösung Die Ver­schie­bung des pH-Wer­tes durch die Stopp­lö­sung be­en­det die Re­ak­ti­on und führt zu einem Far­bum­schlag nach Gelb. Nach dem Ab­stop­pen bleibt die Farb­in­ten­si­tät sta­bil.

Quel­le (ver­än­dert nach):

Dr. Tho­mas Wendt, Dr. Rolf Lutz, Dr. Fred En­gel­brecht:

Ex­plo­Hei­del­berg / Lern­la­bor
Im Neu­en­hei­mer Feld 582
D-69120 Hei­del­berg

Tel.: 06221/421403
Fax: 06221/421410
eMail: lern­la­bor@​explo-​hei­del­berg.​de