Material 4: Lösung

• mRNA für Cas9 bestellen (z.B. bei World of CRISPR technologies)
• guide-RNA für Cas9 bestellen, deren variable Sequenz spezifisch an der zu verändernden Stelle der DNA schneidet (z.B. bei World of CRISPR technologies)
• DNA-Sequenzen bestellen, die mittels homologer Rekombination an der Schnittstelle eingefügt werden können und die die Mutation enthalten (z.B. bei Genetic solutions)

Cas9-mRNA, guide-RNA und DNA-Abschnitte für homologe Rekombination werden zusammen per Mikroinjektion in die zu verändernde Zelle eingebracht.

Abbildung erstellt durch Frank Harder, ZPG Biologie

Im Cytoplasma der behandelten Zelle wird zunächst die mRNA von Cas9 translatiert, sodass Cas9-Proteine in der Zelle vorliegen. An Cas9 bindet die guide-RNA, sodass der aktivierte CRISPR-Cas9-Komplex für den Schnitt in der Zielregion aktiviert ist. Sowohl CRISPR-Cas9 als auch die einzufügende DNA müssen nun in den Zellkern gelangen. CRISPR-Cas9 wird dort an der – durch die guide-RNA spezifizierten Stelle – die DNA schneiden und einen Doppelstrangbruch hervorrufen. Die Reparatur durch homologe Rekombination anhand der zugefügten DNA führt dazu, dass die Zelle nun an dieser Stelle veränderte DNA – also die Zielmutation – enthält.

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