Lösungsvorschlag

Herstellung von Insulin

Aufgabe 1

• Abschnitt I — Herstellung des Proinsulingens
  • Man isoliert aus diesem Gewebe eine sogenannte Proinsulin-m-RNA, die an den Ribosomen der Insel-Zellen in das Protein translatiert wird. Diese Proinsulin-m-RNA wird mit Hilfe des Enzyms reverse Transkriptase in eine DNA umgeschrieben.
  • Der RNA-DNA-Doppelstrang wird erhitzt und dadurch aufgespalten. Der RNA-Strang wird durch eine spezielle RNAase abgebaut.
  • Der DNA-Einzelstrang wird mittels DNA-Polymerase zu einem Doppelstrang ergänzt.
  • An den DNA-Doppelstrang wird das Trinukleotid „ATG“ angehängt, das für die Aminosäure Methionin codiert.
  • Um in das Plasmid eingebaut werden zu können, benötigen die Enden der Proinsulin-DNA noch die zugehörigen sticky-ends.

• Abschnitt II — Rekombination und Selektion
  • Schneiden des Plasmids mit EcoRI. Inkubieren des geschnittenen Plasmids mit der copy-DNA. Aufnahme von Plasmiden in die aufnahmebereiten Bakterien.
  • Selektion derjenigen Bakterien, die ein rekombiniertes Plasmid aufgenommen haben. Vermehrung dieser Bakterien.

• Abschnitt III — Reinigen und Prozessieren des Proinsulins
  • Synthese des Proinsulins in den Bakterien. Aufschluss und Gewinnung des Proinsulins.
  • Das Protein besteht nun einerseits aus einem Teil des ß-Galaktosidase-Gens und dem Proinsulin (A-, B- und C-Kette). Durch die Behandlung mit Bromcyan wird an der eingefügten Aminosäure Methionin das Fusionsprotein gespalten.
  • Enzymatisch wird nun die C-Kette aus dem Proinsulin-Molekül herausgeschnitten. Übrig bleibt das fertige Humaninsulin-Molekül.

Aufgabe 2

• Das Trinukleotid „ATG“ codiert für die Aminosäure Methionin. Dieses Nukleotid sitzt später genau an der Nahtstelle zwischen dem Rest des ß-Galatosidase-Gens und dem Proinsulin-Gen. Bromcyan spaltet gerade an dieser Stelle das spätere Protein. So wird das Fusionsprotein in das Proinsulin und den Rest der ß-Galaktosidase gespalten.

Aufgabe 3

• Da es sich bei den beiden Polypeptidketten des Insulinmoleküls um sehr kurze Ketten handelt, lässt sich die Synthese der zugehörigen Nukleotidsequenzen (incl. der zugehörigen sticky-ends) künstlich vollziehen. Daraufhin werden diese synthetischen Gene in verschiedene Plasmide eingebaut. Die in unterschiedlichen Ansätzen rekombinierten Plasmide werden auf getrennten Wegen in E.coli-Zellen eingeschleust. Die rekombinierten Bakterien werden jeweils selektiert, anschließend vermehrt und die jeweiligenTransgene exprimiert. Nach Isolierung der beiden Proteinvorstufen, der Bromcyanspaltung und Abspaltung des ß-Galaktosidaseabschnitts , werden die so gewonnenen A- und B-Ketten des Insulins über Disulfidbrücken miteinander zum fertigen Insulinmolekül verknüpft.

Arbeitsauftrag

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