Zur Hauptnavigation springen [Alt]+[0] Zum Seiteninhalt springen [Alt]+[1]

Lösungsvorschlag


Lösung Herstellung von Insulin

Aufgabe 1

  • Abschnitt I — Herstellung des Proinsulingens
    • Man isoliert aus diesem Gewebe eine sogenannte Proinsulin-m-RNA, die an den Ribosomen der Insel-Zellen in das Protein translatiert wird. Diese Proinsulin-m-RNA wird mit Hilfe des Enzyms reverse Transkriptase in eine DNA umgeschrieben.
    • Der RNA-DNA-Doppelstrang wird erhitzt und dadurch aufgespalten. Der RNA-Strang wird durch eine spezielle RNAase abgebaut.
    • Der DNA-Einzelstrang wird mittels DNA-Polymerase zu einem Doppelstrang ergänzt.
    • An den DNA-Doppelstrang wird das Trinukleotid „ATG“ angehängt, das für die Aminosäure Methionin codiert.
    • Um in das Plasmid eingebaut werden zu können, benötigen die Enden der Proinsulin-DNA noch die zugehörigen sticky-ends.
  • Abschnitt II — Rekombination und Selektion
    • Schneiden des Plasmids mit EcoRI. Inkubieren des geschnittenen Plasmids mit der copy-DNA. Aufnahme von Plasmiden in die aufnahmebereiten Bakterien.
    • Selektion derjenigen Bakterien, die ein rekombiniertes Plasmid aufgenommen haben. Vermehrung dieser Bakterien.
  • Abschnitt III — Reinigen und Prozessieren des Proinsulins
    • Synthese des Proinsulins in den Bakterien. Aufschluss und Gewinnung des Proinsulins.
    • Das Protein besteht nun einerseits aus einem Teil des ß-Galaktosidase-Gens und dem Proinsulin (A-, B- und C-Kette). Durch die Behandlung mit Bromcyan wird an der eingefügten Aminosäure Methionin das Fusionsprotein gespalten.
    • Enzymatisch wird nun die C-Kette aus dem Proinsulin-Molekül herausgeschnitten. Übrig bleibt das fertige Humaninsulin-Molekül.

Aufgabe 2

  • Das Trinukleotid „ATG“ codiert für die Aminosäure Methionin. Dieses Nukleotid sitzt später genau an der Nahtstelle zwischen dem Rest des ß-Galatosidase-Gens und dem Proinsulin-Gen. Bromcyan spaltet gerade an dieser Stelle das spätere Protein. So wird das Fusionsprotein in das Proinsulin und den Rest der ß-Galaktosidase gespalten.

Aufgabe 3

  • Da es sich bei den beiden Polypeptidketten des Insulinmoleküls um sehr kurze Ketten handelt, lässt sich die Synthese der zugehörigen Nukleotidsequenzen (incl. der zugehörigen sticky-ends) künstlich vollziehen. Daraufhin werden diese synthetischen Gene in verschiedene Plasmide eingebaut. Die in unterschiedlichen Ansätzen rekombinierten Plasmide werden auf getrennten Wegen in E.coli-Zellen eingeschleust. Die rekombinierten Bakterien werden jeweils selektiert, anschließend vermehrt und die jeweiligenTransgene exprimiert. Nach Isolierung der beiden Proteinvorstufen, der Bromcyanspaltung und Abspaltung des ß-Galaktosidaseabschnitts , werden die so gewonnenen A- und B-Ketten des Insulins über Disulfidbrücken miteinander zum fertigen Insulinmolekül verknüpft.


Arbeitsauftrag


Lösungsvorschlag: Herunterladen [pdf] [240 KB]

Lösungsvorschlag: Herunterladen [doc] [32 KB]

Lösungsvorschlag: Herunterladen [docx] [22 KB]